Prof. José Vagner Gomes

ENGENHARIA GENÉTICA
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

1. Introdução
A Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Um exemplo seria o isolamento, extração e o enxerto de gene humano para a produção de insulina em bactérias da espécie Escherichia coli. Essas bactérias, contendo o gene humano, multiplicam-se quando cultivadas em laboratórios, produzindo insulina, o que atualmente é realizado em grande escala.

2. Vetores utilizados em Engenharia Genética

2.1 - Plasmídeo bacteriano
As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biológicos empregados na Tecnologia do DNA Recombinante. Isto se deve a vários fatores:
- ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores.
- cultivo de um grande número de indivíduos em um espaço pequeno
- apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores
- divisão celular por fissão binária.
Além do DNA cromossômico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas PLASMÍDEOS. Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas.
Em Engenharia Genética, genes "estranhos" a bactéria podem ser incorporados aos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam.
Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria.
Os plasmídeos portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência). Eles possuem também, genes que permitem sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência).
Quando dois ou mais tipos de plasmídeos R estão presentes em uma mesma bactéria, os genes de um deles pode passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídeos R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos.
Essa propriedade de genes para resistência a antibióticos passarem de uma molécula de DNA para outra fez com que os cientistas os classificasse de transposons ou genes saltadores.

2.2 - Vírus
Os vírus, principalmente o bacteriófago conhecido como fago lambda, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante.
O fago lambda possui genes essenciais que são indispensáveis à reprodução, e também genes não essenciais, cuja presença é dispensável a multiplicação viral. Os genes essenciais produzem as proteínas da cápsula e as enzimas que atuam na duplicação do DNA viral. Esses genes estão localizados nas extremidades do cromossomo do vírus. Entretanto, os genes não essenciais estão relacionados aos processos de recombinação entre moléculas de DNA, e se localizam na região mediana do cromossomo viral, sem interferir na reprodução do vírus, sendo portanto dispensáveis.

A região mediana do cromossomo, onde se localizam os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado.
Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias o que é necessário ao estudo de genes.

2.3 - Lipossomos
São essencialmente esferas de membrana sintética formadas por camadas bilipídicas preenchidas com DNA. Eles se fundem espontaneamente com a membrana celular, liberando seu conteúdo no citoplasma. Apresentam a vantagem de nunca causar doença alguma, porém apresentam pouca eficiência.

3.1 - Obtenção de Genes para Enxerto
Há na realidade três formas fundamentais para obtermos genes para enxerto: criar-se a chamada "biblioteca" de genes, fabricar-se o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro ou sintetizar-se o gene, nucleotídeo por nucleotídeo, na seqüência desejada.
· Biblioteca de genes
Uma biblioteca de genes é uma coleção de um grande número de fragmentos de DNA do genoma. Cada fragmento, contendo apenas um gene é inserido em um vetor, que pode ser um plasmídeo bacteriano ou um fago.

· Síntese do gene através do RNA mensageiro
Às vezes o pesquisador dispõe do RNA mensageiro responsável pela codificação de determinada proteína. A partir desse RNA, pode ser fabricado em laboratório um segmento de DNA com uma seqüência complementar. Esse DNA, evidentemente, terá uma seqüência idêntica a do gene que produziu originalmente o RNA mensageiro. Um dos trunfos nessa técnica é utilização de uma enzima chamada transcriptase reversa, que permite a produção de DNA a partir de uma molécula de RNA. O DNA assim produzido é chamado de cDNA ou DNA complementar.
· Síntese do gene por adição de nucleotídeos
Isso é feito normalmente para genes que codificam polipeptídeos ou proteínas de pequeno tamanho. Suponha que conheçamos a seqüência de aminoácidos de um pequeno polipeptídeo. Cada aminoácido, você deve se lembrar, é codificado por uma seqüência de três nucleotídeos de DNA, chamada códon. Basta utilizar a tabela do código já conhecida para sermos capazes de construir uma seqüência de nucleotídeos que corresponda exatamente à seqüência de aminoácidos da proteína.

3.2 - Enzimas de Restrição
A base da técnica do DNA recombinante é a utilização de enzimas de restrição. Essas enzimas são capazes de cortar uma molécula de DNA em locais bem específicos, ou seja, cada tipo de enzima de restrição reconhece apenas uma certa seqüência de nucleotídeos e efetua o corte somente ao encontrar essa seqüência na molécula de DNA.
Cada bactéria tem suas próprias enzimas de restrição e cada enzima reconhece apenas um tipo de seqüência, independentemente da fonte do DNA.
O esquema a seguir, explica melhor o fenômeno e demonstra a técnica de se enxertar um pedaço de DNA estranho (gene) num plasmídeo bacteriano. O gene a ser enxertado pode ser obtido de animal, de planta ou ser preparado em laboratório. Repare que tanto o plasmídeo quanto o pedaço de DNA a ser enxertado têm que ser submetidos à mesma enzima de restrição, que os cortará em regiões com a mesma seqüência, de forma a aparecerem extremidades soltas complementares que possam se soldar. O resultado é o DNA recombinante constituído do plasmídeo e do gene novo enxertado.

3.3 - DNA recombinante
O DNA recombinante é uma molécula híbrida obtida pela união de DNAs de fontes biologicamente diferentes. Esses segmentos de DNAs de organismos diferentes são cortados pela mesma enzima de restrição e unidos pela enzima DNA ligase, produzindo dessa forma uma molécula híbrida, que é o DNA recombinante.

3.4 - Clonagem molecular
Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é inseri-los em células bacterianas. Plasmídeos e células bacterianas são postos um em contato com o outro. No entanto, apenas algumas bactérias conseguem absorver o plasmídeo novo, sendo necessário agora, selecionar na população de bactérias aquelas que realmente incorporaram o plasmídeo com o gene novo.
Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico. Em seguida, esses plasmídeos são abertos, e os genes a serem enxertados são encaixados. Esses plasmídeos são colocados em contato com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam. Para selecionar as bactérias que ganharam o plasmídeo novo basta adicionar o antibiótico ao meio de cultivo. Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, por não serem resistentes ao antibiótico, restando somente as que possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico. Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo.

3.5 - Expressão de genes clonados em bactérias
Tão logo foram desenvolvidas as técnicas básicas de clonagem molecular, os biólogos concluíram que um gene de interesse, se estivesse ligado a um plasmídeo e fosse introduzido em uma bactéria, poderia eventualmente funcionar. As bactérias portadoras desse gene se transformariam em verdadeiras fábricas, produzindo quantidades ilimitadas de proteínas que o gene codifica.
A primeira vez que se obteve síntese de uma proteína humana por uma bactéria transformada foi em 1977. Um segmento de DNA de 60 pares de bases, contendo o código para a síntese da somatotrofina (hormônio de crescimento). Foi ligado a um plasmídeo e introduzido em uma bactéria, a partir da qual foram obtidos clones capazes de produzir somatotrofina.
Outros genes que codificam proteínas de interesse médico têm sido transplantados para bactérias, onde passam a funcionar. Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.

4. Uso do Dna Recombinante na Terapia Gênica, e na produção de medicamentos

4.1 - Terapia gênica
Pela primeira vez, um método de terapia gênica reverteu os efeitos de uma doença genética chamada imunodeficiência combinada grave ligada ao cromossomo X (SCID).
Pacientes que sofrem dessa doença, chamada SCID, são obrigados a viver em ambientes completamente isolados (como no filme "o rapaz da bolha de plástico"), pois o sistema imunológico não defende o corpo de infecções. No caso dos bebês da pesquisa, a doença impedia a produção de glóbulos brancos pela medula óssea.

Metodologia
· Pesquisadores retiraram do vírus os genes que o tornam capazes de causar doenças. Em seu lugar foi inserido o gene remédio, isto é, que produzia corretamente a proteína defeituosa e que corrigia o problema nas células.
· O vírus modificado foi misturado com células-tronco da medula óssea retiradas dos bebês. O vírus infecta as células e passa os genes terapêuticos.
· Com o gene terapêutico, as células-tronco passam a produzir a proteína responsável pela estimulação das células de defesa, fazendo com que estas se desenvolvam, cresçam e se espalhem pelo corpo, destruindo os invasores.

4.2 - Biotecnologia animal e produção de medicamentos
Quando se pensa nos animais como fábricas de proteínas interessantes para o Homem, o exemplo da insulina é o mais conhecido. No entanto, cientistas canadenses conseguiram transformar vesículas seminais de ratinhos em "biorreatores" (fábricas biológicas de substâncias de interesse).
Para testar a viabilidade da técnica foi escolhida a proteína hGH (Hormônio de crescimento humano).

Metodologia
· Para montar o "gene artificial", além da seqüência de bases contendo as instruções para produzir o hGH, foi utilizado também um promotor (seqüência especial de DNA que indica que tipo de tecido ou órgão o gene deve agir).
· O DNA construído (transgene) foi microinjetado em vários embriões de camundongos. Obteve-se então, animais transgênicos produzindo hGH no seu sêmen.
· O próximo passo é conseguir produzir o hormônio de crescimento (hGH) no fluído seminal do porco, dado que esse animal ejacula o maior volume de líquido seminal entre todos os animais domésticos.

Questões

1. (UFF-2001) No decorrer de uma pesquisa em laboratório, procedeu-se conforme o descrito a seguir:
I) Tomou-se, inicialmente, um plasmídeo dentre cujos genes estudaram-se dois: um que conferia resistência ao antibiótico tetraciclina (Tet) e outro que codificava a enzima beta-galactosidase (lacZ).
II) Inseriu-se este plasmídeo em uma linhagem de bactéria E. coli que apresentava a mutação lac Z (gene não funcionante). O plasmídeo restaurou, então, nesta bactéria, a habilidade de crescer em lactose, tornando-a resistente à tetraciclina.
III) A seguir, utilizaram-se enzimas de restrição, introduziu-se um segmento de DNA e formou-se novo plasmídeo que foi inserido em bactéria E. coli lac Z. Estas bactérias foram cultivadas em um meio de cultura especial, contendo tetraciclina, e observou-se o aparecimento de bactérias que, em sua totalidade, apresentaram coloração branca.
Saiba que a presença da atividade beta galactosidase pode ser facilmente testada pois, no meio em que as bactérias foram cultivadas, as que utilizam lactose tornam-se azuis e, as demais, brancas.

Considere as informações dadas e responda:
Algum dos genes estudados no plasmídeo inicial continuou funcionante no plasmídeo modificado? Justifique a resposta.

2. (UnB-1999) Chega ao mercado um novo fármaco inteiramente desenvolvido no país
A insulina humana recombinante, um dos mais importantes produtos do avanço científico nacional na área de engenharia genética, está prestes a chegar ao mercado, com o nome de Biohulin: a empresa BIOBRÀS, uma das quatro empresas em todo o mundo e a única no hemisfério sul a deter a tecnologia de produção desta insulina, inicia em 1999 a comercialização do produto.
Uma parceria entre a BIOBRÁS e a Universidade de Brasília (UnB), em 1988, du início aos trabalhos. Ao grupo da UnB coube a parte de biologia molecular, desenvolvendo clones de bactérias produtoras de insulina. Esta conquista tecnológica permitirá o desenvolvimento de outros medicamentos, como o hormônio de crescimento, a calcitonina e o interferon.
Com o auxílio do texto, julgue os itens abaixo.
(1) As técnicas de engenharia genética permitem a recombinação de genes entre organismos totalmente diferentes.
(2) Para que uma bactéria passe a produzir insulina humana, ela deve receber altas doses dessa proteína.
(3) O Biohulin será um medicamento destinado ao tratamento de diabéticos.
(4) A partir da insulina produzida por bactérias, pode ser obtido o hormônio de crescimento.

3. (UFSCar-2000) Considerando duas situações hipotéticas, Maria manteve relações sexuais com dois irmãos, gêmeos dizigóticos, nascendo destas relações Alfredo. Em outra situação, também hipotética, Paula engravidou-se ao manter relações sexuais com dois irmãos, gêmeos monozigóticos, nascendo Renato. Abandonadas, ambas reclamaram na Justiça o reconhecimento de paternidade, determinando o Juiz a realização dos testes de DNA. Após receber os resultados, a Justiça pronunciou-se sobre a paternidade de uma das crianças e ficou impossibilitada de pronunciar-se sobre a paternidade da outra criança. Responda:
a) sobre a paternidade de qual criança o Juiz pronunciou-se?
b) Por que não pode o Juíz se pronunciar sobre a paternidade da outra criança?

4. (UFRJ-1996) O genoma da bactéria E. coli tem um tamanho de 4 x 106 pares de nucleotídeos. Já o genoma haplóide humano tem 3 x 109 pares de nucleotídeos. Para replicar o genoma, antes da divisão celular, existe uma enzima, a DNA polimerase, cuja velocidade de reação é equivalente a cerca de 800 nucleotídeos/s. Assim, para replicar todo o genoma de uma bactéria, a DNA polimerase consumiria cerca de 83 minutos e, para o genoma humano, aproximadamente 43 dias.
Sabemos, no entanto, que o tempo de geração da E.coli é de cerca de 20 minutos, e que o tempo médio de replicação de uma célula eucariota é de 12 horas.
Assumindo que a DNA polimerase apresenta uma velocidade de reação constante para todas as espécies analisadas, explique essa aparente contradição.

5. (Fuvest-1997) Enzimas de restrição são fundamentais à engenharia genética porque permitem:
a) a passagem de DNA através da membrana celular
b) inibe a síntese de RNA a partir do DNA
c) inibe a síntese de DNA a partir de RNA
d) cortar o DNA onde ocorrem seqüências específicas
e) modificar seqüências de bases do DNA

6. (Fuvest-1997) Uma conquista recente no campo da Biotecnologia é o uso de bactérias para a produção de proteína animal de interesse comercial. Por exemplo, hoje já estão sendo comercializadas Insulinas e Somatotrofina Humanas produzidas por bactérias.
a) Em que locais do corpo humano são produzidas essas proteínas e qual é a função de cada uma delas no organismo?
b) Explique sucintamente o processo por meio do qual se modificam bactérias para que elas passem a produzir proteínas humanas.

7 (Puc-SP) Em um experimento de Engenharia Genética, alguns pesquisadores introduziram em células bacterianas uma seqüência de DNA ativo, responsável pela produção de insulina humana. A síntese desse hormônio protéico no interior das bactérias é:
a) Possível, pois, executando-se a referida seqüência de DNA, as bactérias apresentam os componentes necessários à síntese de proteínas.
b) Possível, se além do referido gene forem introduzidos ribossomos, componentes celulares ausentes em bactérias.
c) Impossível, pois o RNA mensageiro correspondente à insulina não seria transcrito.
d) Impossível, pois as bactérias não apresentam enzimas capazes de promover as ligações peptídicas encontradas na insulina.
e) Impossível, pois o DNA bacteriano seria destruído pelo DNA humano e as células perderiam a atividade.

8. (Fuvest-mod.) "A Biotecnologia vegetal ainda está engatinhando, se considerarmos as promessas para o ano 2000. Veja bem o que já é feito, através de processos biotecnológicos, insere-se em determinadas plantas um microorganismo benéfico, o rizóbio, que ajuda a nitrogenização das próprias plantas, ou seja, diminui a necessidade de adubos nitrogenados." (Jornal da Tarde, 27/08/87).
O texto aponta uma das muitas possibilidades de emprego da biotecnologia em condições naturais, bactérias do gênero Rhizobium já vivem há milênios em estreita relação ecológica com plantas leguminosas. Explique e determine o tipo de relação entre esses dois organismos.

9 (UFU-1993) A técnica do PCR (Polimerase Chain Reaction) deu o Prêmio Nobel de Química ao pesquisador americano Kary Mullis. Nesta técnica, mudanças de temperatura são utilizadas para copiar, repetidamente, pequenas quantidades de DNA e obter amostras grandes o suficiente para serem analisadas, utilizando-se outras técnicas. A partir de uma fita G-T-A-A-C-C-T-T-A-A-T-G. Por exemplo é correto afirmar que:
a) poder-se-ia obter a fita complementar C-A-T-T-G-G-A-T-C-T-C-G
b) a partir da fita original multiplicada, utilizando-se PCR, é possível transcrever um RNA que seria composto por oito nucleotídeos de Uracil (U)
c) a fita original de restrição corresponderia a um máximo de 3 códons e poderia ser traduzida numa cadeia de três aminoácidos.
d) se uma enzima de restrição corta a fita complementar sintetizada, toda vez que aparece a seqüência ATT, ela vai cortar a fita em três pedaços.
e) o aminoácido valina, que corresponde ao t-RNA com anti-códon G-T-A seria o primeiro aminoácido inserido na cadeia formada pela tradução da fita original.

10. Como seria possível obter um rebanho de ovelhas capazes de produzir insulina humana?

11. Que características dos plasmídeos e dos bacteriófagos permitem que eles sejam usados como vetores na clonagem de genes?

12. O que é clonagem molecular? Explique resumidamente como se faz a clonagem utilizando plasmídeos recombinantes ou vírus.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. WATSON, J. D. e colaboradores. O DNA recombinante. 2° ed.. Editora UFOP. Ouro Preto, 1997.
2. ALBERTS, B. e colaboradores. Biologia Molecular da Célula. 3° ed. Editora Artes Médicas. Porto Alegre, 1997.
3. RIFKIN, J. O Século da Biotecnologia. Editora Makron Books. São Paulo, 1999.
4. AMABIS, J. M. & MARTHO, R. G. Biologia dos organismos. v. 3. Editora Moderna. São Paulo, 1997.
5. LOPES, S. G. B. C. Bio. v. 3. Editora Saraiva. São Paulo, 1997.
6. Revista Superinteressante. n° 139, abril, 1999.